研究内容

生物は、自分の体をつくり生存していくために必要な非常に多くの情報を持っています。これらの情報は子孫に伝えられ遺伝情報と呼ばれています。遺伝情報を基にタンパク質が作られそのタンパク質が働くことにより遺伝情報が発現したことになり色々な生命現象が現れます。これらの遺伝情報は常に全てが発現しているわけではなく、適切な時期に適切な細胞で発現し、始めて正常な生命活動が行われることになります。従って遺伝情報の発現機構とその制御機構の解析は、生物の形作りや営みを考える上で重要な問題となっています。遺伝情報は転写によりRNAに写され、次に翻訳によりタンパク質ができます。遺伝情報の発現はこれらの色々なレベルで制御を受けています。最近このような制御にエピジェネティックな修飾や各種のRNA分子が関わっていることがわかりつつあります。当研究室では、シロイヌナズナを材料としてエピジェネティックな遺伝子の制御機構やRNA分子による遺伝子発現制御機構を調べ、これらの機構が生体のどのような現象に関係しているか調査しようとしています。

また環境ストレスは遺伝子やトランスポゾンの活性化に影響を与えることが報告されています。トランスポゾンは様々な生物に広く存在しゲノム構造の主たる構成要素となっており、このことは環境ストレスによって活性化されたトランスポゾン配列がゲノム構造の変化、遺伝子発現の変化をもたらし、その結果生物種に多様性を生み環境適応能力を獲得した個体を作り上げてきたと考えることができます。私たちは環境ストレスが植物に与える影響について「ゲノム構造の変化と環境適応」いう側面からアプローチし、実際にこの仮説を検証するために植物においてストレス条件下で活性化するようなトランスポゾンとそれを制御する宿主側の遺伝子の解析を行っています。

acl2変異体の解析 | アンチセンスRNAの機能解析 | RNA結合タンパク質の解析 |
機能を持つ non-coding RNA の探索 | 環境ストレスとゲノム進化

acl2変異体の解析

ある遺伝子産物の機能を知るため には、その遺伝子に変異が起きた生物を調べることが非常に有効な手段である。これまでに、タンパク質をコードする色々な遺伝子に関する変異体が解析され、 それぞれの遺伝子産物の生体内の働きが分かってきた。最近になって多くの分子種が見つかっているnon-coding RNAの機能解析にも同様な方法が考え られるが、現在の所non-coding RNAの 遺伝子に変異が起きて表現型が現れている例は非常に少ない。
acl2変異体は、葉などの大きさは野性 形と変わらずに、花茎の長さのみが著しく短くなる変異体である(図-1)。この原因配列を同定したところ、non-coding RNAの遺伝子に変異が起きていることが示唆された。マッピングを行ったところ、第一染色 体の100 map unit あたりに原因配列が存在するこ とが分かった。この領域のコンティグDNAを4つのP1クローンと1つのBACクローンで作製し、その配列を 野性体と変異体で比較したところ、1つの塩基が置換されていること が分かった(野性体でGが変異体でAになっていた)。この変異塩基はORF中には存在せず、上流と下流にある遺伝子の発現も野性体と変異体で変化 が見られなかった(図-2)。しかし、野性体からクロー ニングした変異部分を含む適当なDNA断片を変異体に導入すると、表 現型が色々な程度に回復した(図-3)。従って、この領域のDNA配列が花茎伸長に対してトランスに働いていることが考えられた。

acl2変異体の解析

この領域から何らかのRNA分子が転写されていると考え、3’-race法を用いて転写産物の検出を試み た。その結果、変異塩基を含む、両方向の転写産物が存在することが分かった(図-5)。5’-raceによる解析も行い、これらの塩 基配列を決めたところ、イントロンは検出されなかったが3’端のpolyA配列が確認され、RNAポリメレースIIによる転写産物であることが確かめられた。さらに、データーベースの検 索から、この変異付近からはいくつかの短いRNA分子が作られていることが示唆 された(図-4)。実際に低分子分画のRNAをRT-PCRで増幅後、適当なプローブで検出すると、少なくとも一部の低分子RNAが検出された(図-6)。現在は、両方向の長い転写産物から短いRNAが作られ、これらが他の遺伝子の発現に影響を与えて、花茎の伸長を制御 していると考えている。

acl2変異体の解析2

一方、花茎伸長に、より直接影響 を与えている遺伝子を同定するためにDNAアレイを用いて、野性体と変異 体で発現が変化している遺伝子を調査した。その結果、変異体の花茎で発現が増加している遺伝子と減少している遺伝子が見つかった(図-7)。これらの中でどの遺伝子が花茎伸長に関係しているか調べるために挿 入変異体や過剰発現体を用いた解析を行っている。例えば、変異体で発現量が増加しているある遺伝子を35Sプロモーターを用いて野性体で過剰発現すると、矮性の表現型を表す遺伝 子が見つかってきている(図-8)。

acl2変異体の解析3

今後、低分子RNAもしくはnon-coding RNAが他の遺伝子の発現を制御する機 構、その機構に1つの塩基置換が影響を与える仕組み、発現量の変動により花茎伸長に影響を与えている遺伝子がコードしているタンパク質の機能等の解析を進 め、non-coding RNAが花茎伸長に影響を与えている 全体像を解明しようとしている。

アンチセンスRNAの機能解析

シロイヌナズナで見つかったレトロトランスポゾン、AtRE1は配列解析より現在も転移活性がある可能性が考えられるが、ゲノムを安定に保持するために、通常の状態では何らかの方法で発現が抑制されていると考えられる。転写産物の検出を試みたところ、センス方向のRNAは非常にわずかしか検出されなかったが、アンチセンス方向のRNAを検出することができた(図-1)。GUS遺伝子をリポーター遺伝子として利用した解析から、アンチセンス方向のプロモーターはセンスRNAのORF内に存在し、花粉やカルスで活性化していることが示された(図-2)。さらに、一部の幼芽でもわずかのプロモーター活性が検出されることがあった。一方、センスRNAのプロモーターにGUS遺伝子をつないでもGUS活性は検出されなかったが、これに35Sプ ロモーターのエンハンサー配列をつなげると、幼芽においてGUS活性が検出されたことより、LTR配列内に基本的なプロモータ性を持つ配列が存在することが示唆された(図-2)。

AtRE1の両方向のプロモーター活性の検出

これらのことより、AtRE1は基本的には発現する能力を持っていることと、この発現を花粉で転写されるアンチセンス方向の転写産物が抑制している可能性が考えられた。可能性として、花粉で転写されるアンチセンスRNAによりsiRNAが作られ、これがDNAをメチル化することで発芽後の植物体内でのAtRE1の 発現を抑制する、といった機構が考えられる。試験的にDNAメチル化の阻害剤である5-Azacytidine を加えて発芽させたところ、センス、アンチセンス両方向のプロモーターが、幼芽において活性化された(図-3)。従って、少なくとも幼芽期におけるAtRE1のプロモーター活性はDNAのメチル化により、制御されていると考えられる。

メチル化阻害である5-Azacytidineのプロモーター活性に与える影響

現在、詳細なプロモーター配列の同定とこれらの配列におけるDNAのメチル化の調査を進めようとしている。

RNA結合タンパク質の解析

シロイヌナズナには多くのRNA結合タンパク質が存在するが、大部分は恒常的に発現していると思われる。しかし、AtRBP1と名づけたタンパク質は、ノーザン解析やGUS遺伝子を利用した解析から、細胞分裂が盛んな組織で発現していると考えられる(図-1)。このタンパク質はN側半分ほどにRNA結合ドメインを持ち、C側半分にはタンパク質相互 作用に関係するPYモチーフが存在するが機能は不明なドメインがある。挿入変異体が得られていないため、N側半分を過剰発現するトランスジェニック植物とC側 半分を過剰発現するトランスジェニック植物を作製して表現型を観察した。すると、後者において根の成長阻害と葉や鞘が短くなる表現型が観察された(図-2)。これらの結果は、このタンパク質がN側で標的RNAと結合してC側が何らかの機能を果たし、細胞分裂に影響を与えていることを示唆している。

RNA結合タンパク質の解析1

AtRBP1タンパク質がどんなRNA分子と結合しているのかを調べる第一段階として、結合配列の同定を試みた。大腸菌内で発現させたAtRBP1タ ンパク質とランダムなRNA配列を用いて結合実験を行い、タンパク質に結合したRNA分子を集めた。これらの塩基配列を調べたところ、UUAGG配列がもっとも頻繁に現れ、GUAGG, UUAGU配列も現れることが分かった。さらに、これらの配列が2回以上重複していた。従って、AtRBP1タンパク質は2回以上反復しているU/G-U-A-G-G/Uに親和性が高いことが推測された(図-3)。 この結果はゲルリターデイション解析でも確認された(図-4)。

RNA結合タンパク質の解析2

現在、タグとなるペプタイドを付けたAtRBP1タンパク質を植物体内で発現させ、生体内で結合しているRNA分子の同定を進めようとしている。

機能を持つ non-coding RNA の探索

RNA分子の網羅的解析より、シロイヌナズナでは非常に多くの種類のnon-coding RNA(タンパク質情報を持たないRNA)分子が見つかっている。この中にはmRNA-typeと呼ばれる種類(数百から数千塩基の大きさがあり、3’端にpolyA配列が存在する)があり、これらの機能はほとんど分かっていない。これらのRNA分子の中に、実際に機能している分子種が存在しないか、そして、機能しているならばどの様な生命現象に関係しているかを調査している。具体的には次のようなことを調べている。

  1. 近縁種において、類似配列が存在するか、そして転写されているか、配列の保存状況にどのような特徴があるか。
  2. どの様な組織で転写されているか、植物ホルモンや各種ストレス等により、転写量はどの様に変動するか。
  3. 挿入変異体や過剰発現体では、何らかの表現型が観察されるか。

現在の所、表現型が観察されるトランスジェニック植物は得られていないが、植物ホルモンや温度変化に対応してRNAの存在量が変動する遺伝子等が見つかってきており、何らかの機能を見つけることができるのではないかと考えている。

環境ストレスとゲノム進化

環境ストレスが植物に与える影響について「ゲノム構造の変化と環境適応」いう側面から研究を行っています。具体的には環境ストレスと植物ゲノム内に存在するトランスポゾン活性の制御機構の研究を行っています。生物界においてトランスポゾンはゲノム内の大部分を占める構成要素でありゲノム構造を変化させる強力な要素と考えられます。トランスポゾンの転移はゲノム進化の要因となるが宿主ゲノムにとっては有害となる場合が多いため現在までに報告されているほとんどのトランスポゾン配列はDNAのメチル化やヒストン修飾により活性が抑制されています。しかしながら自然界ではそれらのトランスポゾン配列は多くの生物種のゲノム内に広く拡散しており、いつどのようにして拡散したのかという疑問に対する明確な答えは得られていません。また遺伝子内や近傍に挿入されたトランスポゾンはその遺伝子の発現を変化させることが報告されています。これらのことからトランスポゾンはゲノム構造や遺伝子発現を変化させることで生物種の進化の大きな原動力となってきたと考えられます。環境ストレスは遺伝子やトランスポゾン配列のエピジェネティックな修飾に影響を与えることが報告されています。このことは、環境ストレスによって活性化されたトランスポゾン配列がゲノム構造の変化、遺伝子発現の変化をもたらし、その結果環境適応能力を獲得した個体を生み出してきたと考えることができます。この仮説を検証するため植物においてストレス条件下で活性化するようなトランスポゾンとそれを制御する遺伝子に焦点を当て研究しています。実際に環境ストレスにより活性化されるトランスポゾンがゲノム構造の変化、遺伝子発現の変化をもたらし、その結果ストレス耐性のある個体が得られればトランスポゾンが植物の環境適応に重要な役割を果たしているということを実証することができると考えています。

2011年3月13日 Natureに論文を発表しました。
詳しくはhttp://www.sci.hokudai.ac.jp/bio/info/2011/03/post-35.php
論文はこちら
日本語の解説(レビュー)はこちら

2010年9月20日~23日に北海道大学で行われた日本遺伝学会第82回大会で伊藤 秀臣 助教の発表がBest Paper賞に選ばれました。
演題は「siRNAによるシロイヌナズナ熱活性型レトロトランスポゾンの世代間転移制御」です。この発表では植物において環境ストレスによって活性化するトランスポゾンの新規の制御機構の発見が高く評価されました。
発表要旨:トランスポゾンは多くの生物でゲノムの主な構成要素でありゲノム進化の重要な因子となり得るがその転移を制御する仕組みは詳しく理解されていない。我々はシロイヌナズナのcopia型レトロトランスポゾン「ONSEN」が熱ストレスで活性化することを見つけた。ONSENは転写が活性化し染色体外DNAを合成する。またsiRNA合成経路の変異体に熱ストレスを与えると次世代で高頻度に転移が観察されsiRNAがONSENの転移制御に関与することが示された。新規挿入箇所は個体間で異なることから転移は配偶子形成時期に起ることが示唆された。これらの結果からレトロトランスポゾンの新規の転移制御機構について発表した。

siRNAによるシロイヌナズナ熱活性型レトロトランスポゾンの世代間転移制御

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  形態機能学講座合同ジンパ

イベントの様子

  • 6月29日(土)理学部5号館前BBQ広場で形態機能学講座合同のジンギスカンパーティーを行いました。今年は曇り空でしたが、暑すぎず美味しいBBQをいただけました。2019.6.29
  • 3名の新しいメンバーのために新歓パーティーを行いました。2019.4.26
  • 学位授与式が行われました。 ご卒業おめでとうございます。2019.3.25